Posted by on 1 listopada 2018

Jednostki fluorescencji reprezentują aktywność proteazy. Oznakowana FITC .-kazeina była inkubowana z rekombinowanymi białkami HTRA1, w których koniec N został usunięty, wyrażony w Escherichia coli (Panel A), lub podłoże wolne od surowicy zawierające komórki z ludzkiej linii komórek nerkowych HEK293, które stabilnie wyrażały HTRA1 znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) na C-końcu (panel B). Ilość białka HTRA1 zmierzono przez barwienie błękitem Coomassie (panel A); jakość próbek zapewniono przez immunoblotting z przeciwciałem anty-GFP (Panel B). W panelach A i B pręty I reprezentują błędy standardowe. Substytucja aminokwasowa motywu proteazy serynowej S328A, która znosi aktywność proteazy w HTRA1, została wykorzystana jako kontrola ujemna.14 Panel C (po lewej) pokazuje tworzenie kompleksów kowalencyjnych (produkty o dużej masie cząsteczkowej) między .1-antytrypsyną a HTRA1 typu dzikiego lub R370X. Poziom białka HTRA1 mierzono poprzez immunoblotting z przeciwciałem przeciw małemu wirusowi 5 (z prawej). Poziom aktywności proteazy w zmutowanym HTRA1 kodowanym przez cDNA zawierający V297M, A252T lub R302X wynosił 21% do 50% poziomu aktywności w HTRA1 dzikiego typu. Przeciwnie, HTRA1 kodowany przez konstrukt zawierający mutację R370X miał poziom aktywności proteazy podobny do poziomu w HTRA1 typu dzikiego (Figura 2A i 2B). HTRA1 atakuje reaktywną pętlę środkową .1-antytrypsyny, wywołując aktywność proteazy serynowej .1-antytrypsyny, która w ten sposób pośredniczy w tworzeniu kowalencyjnego kompleksu między dwiema cząsteczkami.14 Nie zaobserwowaliśmy tworzenia się stabilnego kompleksu między .1-antytrypsyną. i zmutowany HTRA1 kodowany przez cDNA zawierający V297M, A252T lub R302X. Przeciwnie, HTRA1 typu dzikiego i HTRA1 kodowane przez cDNA zawierający R370X tworzyły stabilne kompleksy z .1-antytrypsyną (Figura 2C).
Nonsense-Mediated Decay
Figura 3. Figura 3. Mediowany zanik zmutowanego RNA HTRA1 Messenger. Panel A pokazuje poziomy RNA informacyjnego HTRA1 (mRNA) w hodowlach fibroblastów skóry z podmiotu II-2, rodzina 1, który jest homozygotycznym nośnikiem HTRAX HTRA1, jako procent średniego poziomu mRNA HTRA1 w komórkach wśród czterech kontroli, z lub. bez leczenia cykloheksymidem (100 .g na mililitr), inhibitorem zaniku, w którym pośredniczy nonsens, przez 4 godziny. Paski I reprezentują standardowe błędy. Panel B pokazuje wyniki Western blotting hodowanych fibroblastów skóry uzyskanych od osobnika II-2, rodziny 1, homozygotycznego nośnika R370X i dwóch kontroli (A i B) przy użyciu przeciwciała anty-HTRA1 (MAB2916, R & D Systems) . Komplementarny DNA dzikiego typu i R370X (cDNA) również testowano, dla odniesienia. Panel C pokazuje wyniki testu odwrotnej transkryptazy-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) z użyciem starterów specyficznych dla sekwencji HTRA1. Znaleźliśmy amplikony PCR o oczekiwanej wielkości (600 bp, strzałka) z cDNA otrzymanym z krwi obwodowej osobnika II-1, rodziny 1, nietkniętego heterozygotycznego nosiciela R370X, ale nie z cDNA z Tematu II-2, Rodziny 1, Homozygota R370X. Kontrolą negatywną była próbka uzyskana od heterozygotycznego osobnika II-1, który nie podlegał odwrotnej transkrypcji. Elektroferogramy pokazują produkty typu dzikiego i zmutowane (1108C . T) pochodzące z genomowego DNA leukocytów od heterozygotycznego osobnika II-1, podczas gdy allel typu dzikiego wykrywano tylko w produktach RT-PCR uzyskanych z RNA leukocyty od tego samego podmiotu.
Jeśli kodon przedwczesnego zatrzymania znajduje się w odległości od co najmniej 50 do 55 nukleotydów przed połączeniem eksonu z eksonem blisko końca 3 , mRNA może ulec degradacji w wyniku rozpadu z udziałem nonsensu. 20 Ponieważ położenie R370X spełnia to kryterium dla rozpadu (fig. 1C), określiliśmy, czy mRNA HTRA1 zawierający R370X ulega degradacji w wyniku rozpadu z udziałem nonsensownego
[więcej w: reh med, vacu activ przeciwwskazania, psychoterapia śląsk ]

Powiązane tematy z artykułem: psychoterapia śląsk reh med vacu activ przeciwwskazania

Posted by on 1 listopada 2018

Jednostki fluorescencji reprezentują aktywność proteazy. Oznakowana FITC .-kazeina była inkubowana z rekombinowanymi białkami HTRA1, w których koniec N został usunięty, wyrażony w Escherichia coli (Panel A), lub podłoże wolne od surowicy zawierające komórki z ludzkiej linii komórek nerkowych HEK293, które stabilnie wyrażały HTRA1 znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) na C-końcu (panel B). Ilość białka HTRA1 zmierzono przez barwienie błękitem Coomassie (panel A); jakość próbek zapewniono przez immunoblotting z przeciwciałem anty-GFP (Panel B). W panelach A i B pręty I reprezentują błędy standardowe. Substytucja aminokwasowa motywu proteazy serynowej S328A, która znosi aktywność proteazy w HTRA1, została wykorzystana jako kontrola ujemna.14 Panel C (po lewej) pokazuje tworzenie kompleksów kowalencyjnych (produkty o dużej masie cząsteczkowej) między .1-antytrypsyną a HTRA1 typu dzikiego lub R370X. Poziom białka HTRA1 mierzono poprzez immunoblotting z przeciwciałem przeciw małemu wirusowi 5 (z prawej). Poziom aktywności proteazy w zmutowanym HTRA1 kodowanym przez cDNA zawierający V297M, A252T lub R302X wynosił 21% do 50% poziomu aktywności w HTRA1 dzikiego typu. Przeciwnie, HTRA1 kodowany przez konstrukt zawierający mutację R370X miał poziom aktywności proteazy podobny do poziomu w HTRA1 typu dzikiego (Figura 2A i 2B). HTRA1 atakuje reaktywną pętlę środkową .1-antytrypsyny, wywołując aktywność proteazy serynowej .1-antytrypsyny, która w ten sposób pośredniczy w tworzeniu kowalencyjnego kompleksu między dwiema cząsteczkami.14 Nie zaobserwowaliśmy tworzenia się stabilnego kompleksu między .1-antytrypsyną. i zmutowany HTRA1 kodowany przez cDNA zawierający V297M, A252T lub R302X. Przeciwnie, HTRA1 typu dzikiego i HTRA1 kodowane przez cDNA zawierający R370X tworzyły stabilne kompleksy z .1-antytrypsyną (Figura 2C).
Nonsense-Mediated Decay
Figura 3. Figura 3. Mediowany zanik zmutowanego RNA HTRA1 Messenger. Panel A pokazuje poziomy RNA informacyjnego HTRA1 (mRNA) w hodowlach fibroblastów skóry z podmiotu II-2, rodzina 1, który jest homozygotycznym nośnikiem HTRAX HTRA1, jako procent średniego poziomu mRNA HTRA1 w komórkach wśród czterech kontroli, z lub. bez leczenia cykloheksymidem (100 .g na mililitr), inhibitorem zaniku, w którym pośredniczy nonsens, przez 4 godziny. Paski I reprezentują standardowe błędy. Panel B pokazuje wyniki Western blotting hodowanych fibroblastów skóry uzyskanych od osobnika II-2, rodziny 1, homozygotycznego nośnika R370X i dwóch kontroli (A i B) przy użyciu przeciwciała anty-HTRA1 (MAB2916, R & D Systems) . Komplementarny DNA dzikiego typu i R370X (cDNA) również testowano, dla odniesienia. Panel C pokazuje wyniki testu odwrotnej transkryptazy-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) z użyciem starterów specyficznych dla sekwencji HTRA1. Znaleźliśmy amplikony PCR o oczekiwanej wielkości (600 bp, strzałka) z cDNA otrzymanym z krwi obwodowej osobnika II-1, rodziny 1, nietkniętego heterozygotycznego nosiciela R370X, ale nie z cDNA z Tematu II-2, Rodziny 1, Homozygota R370X. Kontrolą negatywną była próbka uzyskana od heterozygotycznego osobnika II-1, który nie podlegał odwrotnej transkrypcji. Elektroferogramy pokazują produkty typu dzikiego i zmutowane (1108C . T) pochodzące z genomowego DNA leukocytów od heterozygotycznego osobnika II-1, podczas gdy allel typu dzikiego wykrywano tylko w produktach RT-PCR uzyskanych z RNA leukocyty od tego samego podmiotu.
Jeśli kodon przedwczesnego zatrzymania znajduje się w odległości od co najmniej 50 do 55 nukleotydów przed połączeniem eksonu z eksonem blisko końca 3 , mRNA może ulec degradacji w wyniku rozpadu z udziałem nonsensu. 20 Ponieważ położenie R370X spełnia to kryterium dla rozpadu (fig. 1C), określiliśmy, czy mRNA HTRA1 zawierający R370X ulega degradacji w wyniku rozpadu z udziałem nonsensownego
[więcej w: reh med, vacu activ przeciwwskazania, psychoterapia śląsk ]

Powiązane tematy z artykułem: psychoterapia śląsk reh med vacu activ przeciwwskazania