Posted by on 2 listopada 2018

Pierwsze pięć rodzin włączono do analizy sprzężeń, a jeden członek piątej rodziny i jedna z szóstej rodziny przeszedł badanie neuropatologiczne. Przodkowie zostali zgłoszeni przez uczestnika lub członków rodziny. Wyizolowaliśmy genomowy DNA od 11 osobników z pięciu rodzin z CARASILEM: 5 probandów, 3 nietknięte rodzeństwo i 3 rodziców. Przeprowadzono analizę sprzężeń w genach przy użyciu 763 markerów mikrosatelitarnych (Applied Biosystems). Wyniki Pairwise lod zostały obliczone za pomocą programu MLINK pakietu oprogramowania LINKAGE (wersja 5.2) i pakietu FASTLINK (wersja 4.1) .12,13 Ustanowiliśmy pięć nowych markerów mikrosatelitarnych – M1236, M1238, M1241, M1260 i M1264 – na w oparciu o proste i powtarzalne informacje z University of California, Santa Cruz, Human Genome Browser. Sekwencje primerów dla tych markerów podsumowano w Dodatkowym dodatku (dostępnym wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie). Zaprojektowaliśmy pary primerów do amplifikacji dziewięciu kodujących egzonów HTRA1.
Wyizolowaliśmy genomowy DNA od wszystkich uczestników, w tym od zdrowych osób pochodzenia japońskiego, ustalonych na podstawie autoreferatu. Te osoby kontrolne miały pomiędzy 74 a 90 rokiem życia i nie miały objawów demencji, zgodnie z definicją Mini-Mental State Examination. Otrzymaliśmy próbki fibroblastów z czterech kontroli oraz z Tematu II-2 w Rodzinie 1.
Uzyskaliśmy pisemną, świadomą zgodę osób dotkniętych chorobą i członków ich rodzin oraz pisemną zgodę na kontrolę. Instytucjonalna rada przeglądowa Uniwersytetu Niigata zatwierdziła to badanie.
Test aktywności proteazy HTRA1
W celu ekspresji HTRA1 w Escherichia coli jako fuzji z S-transferazą glutationową, subklonowaliśmy dziki lub zmutowany komplementarny DNA HTRA1 (cDNA), pozbawiony kodonów do 140, do wektora pGEX 6P-3 (GE Healthcare). N-koniec HTRA1 jest toksyczny dla E. coli. Substytucja aminokwasowa motywu proteazy serynowej S328A, która znosi aktywność proteazy w HTRA1, została wykorzystana jako kontrola ujemna.14 Białka fuzyjne transferazy S-glutationowej uległy nadmiernej ekspresji i zostały oczyszczone. Aktywność proteazy, mierzona jako znakowana fluoresceiną izotiocyjanianowa .-kazeina, została oceniona przy użyciu zestawu QuantiCleave Fluorescent Protease Assay Kit (Pierce) i rekombinowanej S-transferazy glutationowej-HTRA1. Aby wyeliminować możliwość, że delecja końca N w HTRA1 wpływa na aktywność proteazową, przeprowadziliśmy również identyczny test proteazy z użyciem podłoża bez surowicy zawierającego komórki trwale eksprymujące pełnej długości dzikiego typu lub zmutowane HTRA1 znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym. na C-końcu. Zielone fluorescencyjne białka HTRA1 znakowane białkiem zostały wykryte za pomocą przeciwciała anty-zielonego białka fluorescencyjnego (Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japan).
Aby zbadać tworzenie się stabilnego kompleksu z .1-antytrypsyną, przejściowo eksprymowaliśmy .1-antytrypsynę oraz cDNA typu dzikiego lub zmutowanego HTRA1 z znacznikiem małpiego wirusa 5 (V5) na końcu C w ludzkiej embrionalnej linii komórek nerkowych. HEK293. Komórki te hodowano w pożywce wolnej od surowicy, a próbki uzyskanego kondycjonowanego podłoża następnie poddano immunoblottingowi z przeciwciałem anty-V5.
Ekspresja HTRA1 i NOG
Całkowity RNA wyizolowano z próbek pełnej krwi lub hodowanych fibroblastów skóry, a cDNA zsyntetyzowano za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej wydajności (Applied Biosystems)
[przypisy: endometrioza na jajniku, piramida zdrowego żywienia dla dzieci, rumia stomatolog ]

Powiązane tematy z artykułem: endometrioza na jajniku piramida zdrowego żywienia dla dzieci rumia stomatolog

Posted by on 2 listopada 2018

Pierwsze pięć rodzin włączono do analizy sprzężeń, a jeden członek piątej rodziny i jedna z szóstej rodziny przeszedł badanie neuropatologiczne. Przodkowie zostali zgłoszeni przez uczestnika lub członków rodziny. Wyizolowaliśmy genomowy DNA od 11 osobników z pięciu rodzin z CARASILEM: 5 probandów, 3 nietknięte rodzeństwo i 3 rodziców. Przeprowadzono analizę sprzężeń w genach przy użyciu 763 markerów mikrosatelitarnych (Applied Biosystems). Wyniki Pairwise lod zostały obliczone za pomocą programu MLINK pakietu oprogramowania LINKAGE (wersja 5.2) i pakietu FASTLINK (wersja 4.1) .12,13 Ustanowiliśmy pięć nowych markerów mikrosatelitarnych – M1236, M1238, M1241, M1260 i M1264 – na w oparciu o proste i powtarzalne informacje z University of California, Santa Cruz, Human Genome Browser. Sekwencje primerów dla tych markerów podsumowano w Dodatkowym dodatku (dostępnym wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie). Zaprojektowaliśmy pary primerów do amplifikacji dziewięciu kodujących egzonów HTRA1.
Wyizolowaliśmy genomowy DNA od wszystkich uczestników, w tym od zdrowych osób pochodzenia japońskiego, ustalonych na podstawie autoreferatu. Te osoby kontrolne miały pomiędzy 74 a 90 rokiem życia i nie miały objawów demencji, zgodnie z definicją Mini-Mental State Examination. Otrzymaliśmy próbki fibroblastów z czterech kontroli oraz z Tematu II-2 w Rodzinie 1.
Uzyskaliśmy pisemną, świadomą zgodę osób dotkniętych chorobą i członków ich rodzin oraz pisemną zgodę na kontrolę. Instytucjonalna rada przeglądowa Uniwersytetu Niigata zatwierdziła to badanie.
Test aktywności proteazy HTRA1
W celu ekspresji HTRA1 w Escherichia coli jako fuzji z S-transferazą glutationową, subklonowaliśmy dziki lub zmutowany komplementarny DNA HTRA1 (cDNA), pozbawiony kodonów do 140, do wektora pGEX 6P-3 (GE Healthcare). N-koniec HTRA1 jest toksyczny dla E. coli. Substytucja aminokwasowa motywu proteazy serynowej S328A, która znosi aktywność proteazy w HTRA1, została wykorzystana jako kontrola ujemna.14 Białka fuzyjne transferazy S-glutationowej uległy nadmiernej ekspresji i zostały oczyszczone. Aktywność proteazy, mierzona jako znakowana fluoresceiną izotiocyjanianowa .-kazeina, została oceniona przy użyciu zestawu QuantiCleave Fluorescent Protease Assay Kit (Pierce) i rekombinowanej S-transferazy glutationowej-HTRA1. Aby wyeliminować możliwość, że delecja końca N w HTRA1 wpływa na aktywność proteazową, przeprowadziliśmy również identyczny test proteazy z użyciem podłoża bez surowicy zawierającego komórki trwale eksprymujące pełnej długości dzikiego typu lub zmutowane HTRA1 znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym. na C-końcu. Zielone fluorescencyjne białka HTRA1 znakowane białkiem zostały wykryte za pomocą przeciwciała anty-zielonego białka fluorescencyjnego (Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japan).
Aby zbadać tworzenie się stabilnego kompleksu z .1-antytrypsyną, przejściowo eksprymowaliśmy .1-antytrypsynę oraz cDNA typu dzikiego lub zmutowanego HTRA1 z znacznikiem małpiego wirusa 5 (V5) na końcu C w ludzkiej embrionalnej linii komórek nerkowych. HEK293. Komórki te hodowano w pożywce wolnej od surowicy, a próbki uzyskanego kondycjonowanego podłoża następnie poddano immunoblottingowi z przeciwciałem anty-V5.
Ekspresja HTRA1 i NOG
Całkowity RNA wyizolowano z próbek pełnej krwi lub hodowanych fibroblastów skóry, a cDNA zsyntetyzowano za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej wydajności (Applied Biosystems)
[przypisy: endometrioza na jajniku, piramida zdrowego żywienia dla dzieci, rumia stomatolog ]

Powiązane tematy z artykułem: endometrioza na jajniku piramida zdrowego żywienia dla dzieci rumia stomatolog