Posted by on 28 maja 2018

Przebadaliśmy ekspresję mRNA RNA (mRNA) HTRA1 w próbkach krwi pełnej za pomocą starterów specyficznych dla genu dla HTRA1. W celu oznaczenia poziomów mRNA HTRA1 w hodowanych fibroblastach skóry w odniesieniu do ekspresji dehydrogenazy 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego, przeprowadziliśmy oznaczenie ilościowe w odwrotnej transkryptazowej reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) w czasie rzeczywistym przy użyciu specyficznych sond i primera TaqMan. zestawy (Applied Biosystems). Przebadaliśmy poziomy mRNA genu noggin (NOG) w hodowlach fibroblastów skóry w zależności od poziomu .-aktyny, stosując RT-PCR ilościowy w czasie rzeczywistym i SYBR Green (Applied Biosystems) (szczegóły, patrz rozdział Metody w Dodatek dodatkowy). Test sygnalizacji przez białka rodziny TGF-.
Zastosowaliśmy system ukierunkowanej mutagenezy (GeneTailor, Invitrogen) do syntezy zmutowanego kodującego cDNA HTRA1 i cDNA kodującego konstytutywnie czynną proproteinę TGF-.1 (pro-TGF-.1 zawierającą mutacje aminokwasów aktywujących C223S i C225S) .15 Następnie indywidualnie subklonować ten cDNA do wektora pcDNA DEST-40 (Invitrogen). Konstytutywnie aktywny TGF-.1 zsyntetyzowano z pro-TGF-.1 zawierającego mutacje aktywujące C223S i C225S. Wyizolowaliśmy cDNA z genu 2 członka rodziny SMAD (SMAD2), uzyskanego z biblioteki cDNA ludzkiego mózgu (Clontech) i subklonowano go do wektora pcDNA DEST-40. Testy lucyferazy przeprowadzono tak, jak opisano uprzednio.16,17 Myoblazy C2C12 (mezenchymalne komórki prekursorowe, otrzymane z American Type Culture Collection) kotransfekowano wektorami ekspresyjnymi HTRA1, plazmidem ekspresji lucyferazy pRL-TK renilla i następującymi konstruktami: (Element wiążący Smad) wektor lucyferazy 4-świetlika (wektor reporterowy reagujący na TGF-.) i wektory zawierające SMAD2, gen 4 członka rodziny SMAD (SMAD4) i TGFB1 (kodujący pro-TGF-.1 z mutacjami dwunitowymi C223S i C225S) 15; wektora lucyferazy pGL3-Id985WT-świetlika (wektor reporterowy morfogenetyczny białko kości [BMP]) 17 i wektory zawierające gen członka rodziny SMAD (SMAD1), SMAD4 i BMP-4 (kodujący pro-BMP-4); i wektor lucyferazy pGL3-Id985WT17 i wektory zawierające SMAD1, SMAD4 i BMP-2 (kodujący pro-BMP-2). 18 Ekstrakty komórkowe badano pod względem aktywności lucyferazy za pomocą układu do podwójnej kontroli lucyferazy (Promega). ). Aktywność lucyferazy skorygowano pod względem wydajności transfekcji przez podzielenie jej przez aktywność lucyferazy pRL-TK renilla. Każdą próbkę transfekowano trzykrotnie i każdy eksperyment powtórzono trzy razy.
Fosforylacja białek SMAD
Komórki HEK293 kotransfekowano wektorami zawierającymi HTRA1 i następujące konstrukty: wektorami zawierającymi SMAD2, SMAD4 i TGFB1 (kodującymi pro-TGF-.1 z mutacjami dwupunktowymi [C223S i C225S]); wektory zawierające SMAD1, SMAD4 i BMP-4; i wektory zawierające SMAD1, SMAD4 i BMP-2,185,18 Komórki poddano lizie w buforze do oznaczania radioimmunoprecypitacji zawierającym inhibitor fosfatazy. Przeprowadziliśmy Western blotting w celu wykrycia SMAD1, fosforylowanego SMAD1, SMAD2 i fosforylowanego SMAD2, z użyciem odpowiednich przeciwciał anty-SMAD (Cell Signaling): anty-SMAD1, anty-fosfo-SMAD1 / 5/8, anty-SMAD 2/3, i przeciwciała anty-fosfo-SMAD2.
Badania immunohistochemiczne i hybrydyzacja in situ
Przeprowadziliśmy barwienie immunoperoksydazą na utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie próbkach mózgu uzyskanych od dwóch pacjentów z CARASILem oraz z czterech kontroli (40-letnia kobieta ze stwardnieniem zanikowym bocznym, 84-letnia kobieta, 62 lata – starszy mężczyzna z udarem i 36-letnia kobieta ze schizofrenią). 9 Pierwszymi stosowanymi przeciwciałami były przeciwciała przeciwko TGF-.1 (1:50, Santa Cruz), przeciwko versican (1: 100, Seikagaku) , a w stosunku do dodatkowej domeny – regionu fibronektyny (1: 100, Abcam)
[hasła pokrewne: psychiatra poznań, psycholog warszawa, psycholog dziecięcy Warszawa ]

Powiązane tematy z artykułem: psychiatra poznań psycholog dziecięcy Warszawa psycholog warszawa

Posted by on 28 maja 2018

Przebadaliśmy ekspresję mRNA RNA (mRNA) HTRA1 w próbkach krwi pełnej za pomocą starterów specyficznych dla genu dla HTRA1. W celu oznaczenia poziomów mRNA HTRA1 w hodowanych fibroblastach skóry w odniesieniu do ekspresji dehydrogenazy 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego, przeprowadziliśmy oznaczenie ilościowe w odwrotnej transkryptazowej reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) w czasie rzeczywistym przy użyciu specyficznych sond i primera TaqMan. zestawy (Applied Biosystems). Przebadaliśmy poziomy mRNA genu noggin (NOG) w hodowlach fibroblastów skóry w zależności od poziomu .-aktyny, stosując RT-PCR ilościowy w czasie rzeczywistym i SYBR Green (Applied Biosystems) (szczegóły, patrz rozdział Metody w Dodatek dodatkowy). Test sygnalizacji przez białka rodziny TGF-.
Zastosowaliśmy system ukierunkowanej mutagenezy (GeneTailor, Invitrogen) do syntezy zmutowanego kodującego cDNA HTRA1 i cDNA kodującego konstytutywnie czynną proproteinę TGF-.1 (pro-TGF-.1 zawierającą mutacje aminokwasów aktywujących C223S i C225S) .15 Następnie indywidualnie subklonować ten cDNA do wektora pcDNA DEST-40 (Invitrogen). Konstytutywnie aktywny TGF-.1 zsyntetyzowano z pro-TGF-.1 zawierającego mutacje aktywujące C223S i C225S. Wyizolowaliśmy cDNA z genu 2 członka rodziny SMAD (SMAD2), uzyskanego z biblioteki cDNA ludzkiego mózgu (Clontech) i subklonowano go do wektora pcDNA DEST-40. Testy lucyferazy przeprowadzono tak, jak opisano uprzednio.16,17 Myoblazy C2C12 (mezenchymalne komórki prekursorowe, otrzymane z American Type Culture Collection) kotransfekowano wektorami ekspresyjnymi HTRA1, plazmidem ekspresji lucyferazy pRL-TK renilla i następującymi konstruktami: (Element wiążący Smad) wektor lucyferazy 4-świetlika (wektor reporterowy reagujący na TGF-.) i wektory zawierające SMAD2, gen 4 członka rodziny SMAD (SMAD4) i TGFB1 (kodujący pro-TGF-.1 z mutacjami dwunitowymi C223S i C225S) 15; wektora lucyferazy pGL3-Id985WT-świetlika (wektor reporterowy morfogenetyczny białko kości [BMP]) 17 i wektory zawierające gen członka rodziny SMAD (SMAD1), SMAD4 i BMP-4 (kodujący pro-BMP-4); i wektor lucyferazy pGL3-Id985WT17 i wektory zawierające SMAD1, SMAD4 i BMP-2 (kodujący pro-BMP-2). 18 Ekstrakty komórkowe badano pod względem aktywności lucyferazy za pomocą układu do podwójnej kontroli lucyferazy (Promega). ). Aktywność lucyferazy skorygowano pod względem wydajności transfekcji przez podzielenie jej przez aktywność lucyferazy pRL-TK renilla. Każdą próbkę transfekowano trzykrotnie i każdy eksperyment powtórzono trzy razy.
Fosforylacja białek SMAD
Komórki HEK293 kotransfekowano wektorami zawierającymi HTRA1 i następujące konstrukty: wektorami zawierającymi SMAD2, SMAD4 i TGFB1 (kodującymi pro-TGF-.1 z mutacjami dwupunktowymi [C223S i C225S]); wektory zawierające SMAD1, SMAD4 i BMP-4; i wektory zawierające SMAD1, SMAD4 i BMP-2,185,18 Komórki poddano lizie w buforze do oznaczania radioimmunoprecypitacji zawierającym inhibitor fosfatazy. Przeprowadziliśmy Western blotting w celu wykrycia SMAD1, fosforylowanego SMAD1, SMAD2 i fosforylowanego SMAD2, z użyciem odpowiednich przeciwciał anty-SMAD (Cell Signaling): anty-SMAD1, anty-fosfo-SMAD1 / 5/8, anty-SMAD 2/3, i przeciwciała anty-fosfo-SMAD2.
Badania immunohistochemiczne i hybrydyzacja in situ
Przeprowadziliśmy barwienie immunoperoksydazą na utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie próbkach mózgu uzyskanych od dwóch pacjentów z CARASILem oraz z czterech kontroli (40-letnia kobieta ze stwardnieniem zanikowym bocznym, 84-letnia kobieta, 62 lata – starszy mężczyzna z udarem i 36-letnia kobieta ze schizofrenią). 9 Pierwszymi stosowanymi przeciwciałami były przeciwciała przeciwko TGF-.1 (1:50, Santa Cruz), przeciwko versican (1: 100, Seikagaku) , a w stosunku do dodatkowej domeny – regionu fibronektyny (1: 100, Abcam)
[hasła pokrewne: psychiatra poznań, psycholog warszawa, psycholog dziecięcy Warszawa ]

Powiązane tematy z artykułem: psychiatra poznań psycholog dziecięcy Warszawa psycholog warszawa